ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………….. 6
Глава 1. Обзор литературы ………………………………………………. 18
1.1. Современные представления об особенностях развития
1.1. врожденного адаптивного иммунитета …………………………………… 18
1.2. Особенности развития иммунного ответа при вакцинации
противовирусными вакцинами …………………………………………. 25
1.3 Особенности развития иммунного ответа при инфекции
и вакцинации против вируса бешенства ………………………………. 31
1.4. Особенности развития иммунного ответа при инфекции
и вакцинации против вируса клещевого энцефалита ……………….. 42
1.5. Особенности развития иммунного ответа при инфекции
и вакцинации против вируса гепатита А ……………………………… 48
1.6. Особенности развития иммунного ответа при инфекции
и вакцинации против вируса гепатита В ……………………………… 56
1.7. Адъюванты вакцин ……………………………………………………… 63
1.8. Адъювантные свойства цитокинов при вакцинации ………………… 73
Глава 2. Материалы и методы …………………………………………… 87
2.1. Материалы исследований ……………………………………………… 87
2.1.1. Животные ………………………………………………………… 87
2.1.2. Вирусы …………………………………………………………… 88
2.1.3. Культуральные и вируссодержащие жидкости ……………….. 88
2.1.4. Вакцины, используемые при изучении адъювантных свойств
цитокинов ……………………………………………………….. 89
2.1.5. Вакцины, используемые при изучении содержания в них
цитокинов………………………………………………………… 90
2.1.6. Клеточные субстраты, используемые в производстве
вирусных вакцин ………………………………………………… 91
2.1.7. Препараты, используемые для стимуляции иммунного ответа 91
2.1.7.1. Препараты цитокинов и препараты сравнения,
3
используемые в качестве адъювантов ………………… 91
2.1.7.2. Препараты интерферона, используемые для
стимуляции антигенпрезентирующих клеток ………… 92
2.1.8. Антигены, используемые при проведении исследований ……. 93
2.1.9. Моноклональные антитела ……………………………………… 93
2.1.10. Получение FITC-меченых F(ab)2-фрагментов
иммуноглобулинов ……………………………………………… 94
2.1.11. Исследуемые субпопуляции клеток животных ……………….. 95
2.1.12. Культуральные среды …………………………………………… 95
2.2. Схемы иммунизации экспериментальных животных ……………….. 96
2.2.1. Схема иммунизации антирабической вакциной ………………. 96
2.2.2. Схема иммунизации вакциной против клещевого энцефалита.. 98
2.2.3. Схема иммунизации вакциной против гепатита А ……………. 99
2.2.4. Схема иммунизации вакциной против гепатита В ……………. 100
2.3. Методы исследований ………………………………………………….. 101
2.3.1. Методы изучения гуморального иммунного ответа ………….. 101
2.3.1.1. Определение вируснейтрализующих антител к вирусу
бешенства ………………………………………………. 101
2.3.1.2. Определение гемагглютинирующих антител к вирусу
клещевого энцефалита ………………………………… 101
2.3.1.3. Определение антител к вирусу гепатита А ………….. 102
2.3.1.4. Определение антител к вирусу гепатита В ………….. 102
2.3.2. Методы изучения клеточного иммунного ответа …………….. 102
2.3.2.1. Цитотоксический тест ………………………………… 103
2.3.2.2. Реакция непрямой иммунофлюоресценции ………….. 103
2.3.2.3. Реакция бласттрансформации лимфоцитов ………….. 105
2.3.2.4. Модель индукции эффекторов ГЗТ в условиях
in vitro……………………………………………………. 105
2.3.2.5. Тестирование МИФ-продуцентов …………………….. 106
2.3.3. Методы выявления цитокинов в противовирусных вакцинах .. 106
4
2.3.3.1. Иммуноферментный анализ ………………………….. 106
2.3.3.2. Определение активности ИЛ-6 в биологическом
тесте……………………………………………………… 107
2.3.3.3. Определение активности и подлинности ФНОα
в биологическом тесте ………………………………… 107
2.3.4. Изучение изменения уровня экспрессии АГ ГКГ класса II …… 108
2.3.5. Статистическая обработка результатов исследований ……….. 109
Глава 3. Результаты собственных исследований ……………………… 111
3.1. Изучение влияния цитокинов на эффективность иммунизации
вакцинами против бешенства, клещевого энцефалита, гепатита А
и гепатита В ……………………………………………………………. 112
3.1.1. Адъювантный эффект цитокинов на иммуногенную
активность вакцины против бешенства ……………………….. 112
3.1.2. Адъювантный эффект цитокинов на иммуногенную
активность вакцины против клещевого энцефалита …………. 123
3.1.3. Адъювантный эффект цитокинов на иммуногенную
активность вакцины против гепатита А ………………………. 132
3.1.4. Адъювантный эффект рчФНОα на иммуногенную активность
конъюгированной вакцины против гепатита А ……………….. 138
3.1.5. Изучение возможности преодоления специфической
неотвечаемости с помощью цитокинов при иммунизации
вакциной против гепатита В животных без иммуносупрессии
и иммунодефицитных животных ………………………………. 142
3.1.5.1. Исследования на животных без иммуносупрессии ….. 143
3.1.5.2. Исследования на иммунодефицитных животных …… 150
3.2. Изучение возможности развития иммунного ответа на антиген
у мышей слабо отвечающей линии с помощью адъюванта …………. 160
3.3. Изучение механизмов иммуноадъювантного действия цитокинов … 162
Оценк 3.3.1. Изучение зависимости выраженности иммунного ответа
Оценк от уровня экспрессии антигенов гистосовместимости
5
на антигенпрезентирующих клетках на моделях in vitro …….. 162
3.3.2. Изучение уровня экспрессии АГ ГКГ класса II на клетках
мышей, иммунизированных вакциной КОКАВ на фоне
цитокинов ………………………………………………………… 168
3.4. Изучение содержания провоспалительных цитокинов
в вакцинах и определение источника их происхождения …………… 171
3.4.1. Оценка содержания ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНОα в
противовирусных вакцинах и супернатантах клеточных
культур …………………………………………………………… 171
3.4.2. Изучение спонтанной и антигениндуцированной продукции
цитокинов клетками культур, используемых в качестве
субстратов при производстве вакцин ………………………….. 174
3.5.Совершенствование нормативной документации,
регламентирующей требования к оценке качества
биотехнологических препаратов и проведению доклинических
исследований биотехнологических препаратов, адъювантов и
вакцин с адъювантами ………………………………………………… 178
Глава 4. Обсуждение полученных результатов и заключение ………. 183
Выводы ………………………………………………………………………. 225
Список сокращений …………………………………………………………
Список литературы ………………………………………………………….
229
232
6
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Несмотря на большие успехи в области разработки новых и
совершенствования существующих вакцин, напряженность иммунитета,
развивающегося после введения некоторых вакцин, недостаточно высока.
Выраженность и характер формирующегося иммунного ответа при вакцинации
зависят от генетических особенностей организма и его функционального
состояния, особенностей антигенов и свойств вакцин, пути и схемы их
введения [28, 41, 318]. Следует отметить, что для многих инфекционных
заболеваний, таких как малярия и ВИЧ-СПИД, до настоящего времени
эффективные вакцины не разработаны. Особого внимания заслуживает вопрос
иммунопрофилактики лиц с нарушением иммунного статуса, поскольку они
наиболее чувствительны к инфекционным заболеваниям. К данной группе
относится контингент с нарушением функционального состояния иммунной
системы, пациенты с хронической патологией, лица пожилого возраста и др.
Это требует совершенствования способов иммунопрофилактики и разработки
новых вакцинных препаратов, обеспечивающих надежную защиту организма от
инфекции. В связи с этим поиск путей усиления иммуногенных свойств вакцин
для повышения эффективности вакцинации очень актуален.
Одним из способов повышения иммуногенности вакцин является
использование адъювантов, стимулирующих развитие иммунного ответа.
Целесообразность применения адъювантов заключается в увеличении
иммуногенности антигенов, входящих в состав вакцин, изменении характера
иммунного ответа, снижении количества вводимых антигенов, уменьшении
кратности введения вакцин и повышении интенсивности иммунного ответа у
лиц со сниженной иммунной активностью [28, 132, 290]. При выборе
адъюванта особое внимание уделяется его способности усиливать
иммунологическую память.
7
В качестве клеточного субстрата при производстве многих
противовирусных вакцин используются эпителиальные и фибробластные
клеточные культуры, которые способны продуцировать цитокины. Было
высказано предположение о возможном присутствии цитокинов в
лекарственных препаратах, изготовленных на основе клеток эукариот [168,
379]. Учитывая широкий спектр иммунобиологической активности цитокинов и
возможное их влияние на свойства препаратов, актуальным является изучение
их присутствия в противовирусных вакцинах, а также способности клеточных
культур, используемых в качестве субстрата при производстве вакцин,
секретировать цитокины.
При разработке эффективных вакцин с адъювантами важен выбор
модели, позволяющей оценить повышение иммуногенности вакцины с
адъювантом по сравнению с вакциной без адъюванта. Предварительные
исследования вакцины с адъювантом на животных позволяют выбрать
безопасные и эффективные дозы, подобрать схемы иммунизации, способ
введения, оценить эффективность, а также выявить непредвиденные или
возможные нежелательные реакции, которые необходимо учитывать при
планировании клинических исследований. Актуальным является разработка
требований к изучению адъювантов и вакцин с адъювантами на этапе
доклинических исследований.
В настоящее время биотехнологические лекарственные препараты на
основе рекомбинантных цитокинов человека широко применяются для лечения
ряда тяжелых хронических заболеваний. Перспективным является возможность
использования указанных препаратов в качестве адъювантов для вакцинных
препаратов, обеспечивающих защиту от инфекционных заболеваний.
Производство лекарственных препаратов на основе рекомбинантных цитокинов
требует выполнения специальных требований как к соблюдению условий
производства, контролю критических этапов процесса производства, так и к
методам контроля качества готового препарата. Актуальным является вопрос
совершенствования нормативной базы для биотехнологических лекарственных
8
препаратов, отражающей их особенности и включающей требования к ним на
этапах разработки, оценки качества и доклинического изучения. Важным
аспектом при разработке требований к указанным группам лекарственных
средств является их гармонизация с требованиями нормативных документов
стран с развитой регуляторной системой и рекомендациями Всемирной
организации здравоохранения (ВОЗ).
