диаметр 1 см) наливали 2 мл нейтрализованного до рН 7 вина и 2 мл фосфатного буфера рН 8, а в боковой отросток - 2 мл тионина. Пробирки вакуумировали в течение 3 мин до 10-11 мм рт. ст., термостатировали 10 мин при 37° С, после чего содержимое основного сосуда и бокового отростка смешивали и при строго фиксированном положении трубок измеряли скорость обесцвечивания тионина при Л =605 нм. В контрольных образцах испол ьзовали вино, прокипяченное 30 мин. Наблюдения показали значительную скорость реаю~ии как в опытных, так и в контрольных вариантах. Снижение величины оптической плотности в и·нактив·ироваином ви·не, по всей вероя'Т'ности. обусловлено наличием неферме<нтати&ных процессов. Тем не менее в опытном образце с.карость обесцве•rнва ния была выше, чем в контрольном. Разность между ними позво;1яет судить о фермента'!'ивиой активности. Указа.нный метод может быть применен для характернс1нки суммар~нои актнв·ности деrидрогеиаз вина. Применение вышеописанной методики для исследования специфичес..ких дегидрогеназ встретило трудность в связи с тем, что в вине присутствуют разнообразные суб.страты и добавление отдельного донатора не дало бы полного представления о действии индивидуального фермента. Необходимо было выделить ферменты из вина. С этой целью получали ацетоновые препараты [112), благодаря чему добились значительного повышения а1Ктивности ферментов и одновременно исключили влияние субстратов, присутствующих в вине. Активность дегидрогеназ в ацетоновых препаратах определяли по относительному снижению (ОС) величины оптической плотности раствора с отдельными субстратами. Благодаря этому удалось обнаружить в вине цитрат-, лактат-, 1О 20 30 30 40 1. мнн Рис. 3. Динамика обесцвечивания тионнна дегидрогеназами вина: 1- цитратдегндрогснаэой; 2 - лактатдеrидроrеназоА; 3 - глютаматдегндрогснаэоА; 4 - алкоrольдегндроrеназоА; 5 - малатдегндрогеназоА. 1J11отамат-, мал ат- и алкогольдегидрогеиазы (рис. З). ! ;;~ сдует подчеркнуть, что при получении ацетоновых 11репа ратов происходит частичная инактивация фермен1tщ а анализ активности дегидрогеназ в трубках Тун<kрга является трудоемким. Поэтому ферменты выдеJ1щ1и из вина путем высаливания при минусовой темперnтуре и очистки на сефадексе [5]. Активность дегидро1с11аз определяли более чувствительными и быстрыми метода ми. В связи с тем что ~Концентрация ферментов в вине очень мuJ1a, предварительно лиофилизовали 200-400 мл вJша. JI 11 офилизованный остаток растворяли в фосфатном или rpuc-HCI буфере и насыщали сернокислым аммонием. Осадок ферментов обессоливали пропусканием через 1<0J1О11ку с сефадексом G-25 диаметром 2,4 см и высотой :ю см. Чтобы предотвратить инакт.ивацию ферментов, щ•с операции выделения и очисткw проводили п ри 14°С. Так ка.к предварительные опыты показали, что 1~ •г1щроrеназы и в этом случае частично инактивироваJ1 11сь, при их выделении колонку с сефадексом уравно11('111ивали буферным раствором с цистеином.· Белковые фракции после гелевой фильтрации использовали для 11сследования ферментов. J tм1 определения активности НАД-зависимых деrидро1·с11аз были выбраны оптические методы, основанные на 11 1мсрении скорости восстановления НАДФ или окисJ1с•1111я НАДФ · Н2. В качестве контроля использовали 11113ктивированный кипячением ферментный раствор, из кщ1трольных смесей исключали также субстрат. Было 1кrпсрименталь~о установлено функционирование в вищ• малат- (МДГ), глютамат- (ГДГ), аланин- (АлаДГ), i'ук1tи11ат- (СДГ) и лактатдегидрогеназ (ЛДГ). Обнаруженные в вине описанными двумя методами де111дµогеназы катализируют важные биохимические реакщ111. Алкогольдегидрогеназа (АДГ) ускоряет реакцию Jt~1·11дрирования э"анола в уксусный альдегид: о сн.-сн,-он +НАД= сн,-е<н+ НАд·Н:. 1\м ('IОТСя данные, что этот фермент способен катализир11щ1т1, превращения высших спиртов. Образующиеся 111111 окислении спиртов альдегиды оказывают большое 11J11н111ие на буu<ет вина. 31
RkJQdWJsaXNoZXIy NzQwMjQ=